La produzione eterologa dei cannabinoidi

La produzione eterologa dei cannabinoidi è un processo che permette la produzione di cannabinoidi da un organismo che normalmente non li produrrebbe.

Ciò avviene mediante l’applicazione dell’ingegneria genetica su lieviti, funghi, batteri o alghe, modificati in modo da sintetizzare e immagazzinare cannabinoidi.

Questa tecnica innovativa potrebbe aprire scenari interessanti per quanto riguarda i processi di produzione, soprattutto per quei fitocannabinoidi che non sono espressi in grande quantità nella pianta di cannabis.

Vediamo nello specifico di cosa si tratta.

Indice

• 1. Introduzione
• 2. Produzione di metaboliti secondari con metodi biotecnologici
• 3. Produzione eterologa di cannabinoidi
• 4. Conclusioni e sguardo al futuro sulla produzione eterologa dei cannabinoidi
• 5. Referenze

1. Introduzione

La Cannabis Sativa L. è una pianta medicinale che deve i suoi effetti terapeutici a una miriade di molecole che si trovano all’interno dei suoi tessuti e le più importanti si possono raggruppare in tre grandi classi: fitocannabinoidi, terpeni e polifenoli. ^[1]Andre, Christelle M., Jean-Francois Hausman, and Gea Guerriero.
Cannabis sativa: the plant of the thousand and one molecules.
Frontiers in plant science 7 (2016): 19.

I fitocannabinoidi agiscono principalmente sul Sistema Endocannabinoide, modulando molti processi fisiologici, tra cui sonno, metabolismo e nocicezione. ^[2]Cascio, Maria Grazia, Roger G. Pertwee, and Pietro Marini.
The pharmacology and therapeutic potential of plant cannabinoids. Cannabis sativa L.-Botany and Biotechnology. Springer, Cham, 2017. 207-225.

I terpeni sono molecole volatili, responsabili dell’aroma delle infiorescenze e mediano effetti antinfiammatori, ansiolitici, immunostimolanti ed antibatterici. ^[3]Yang, Wenqiang, et al.
Advances in pharmacological activities of terpenoids.
Natural Product Communications 15.3 (2020): 1934578X20903555.

I polifenoli sono una classe di molecole estremamente diffusa nel mondo vegetale e, grazie alla loro struttura chimica, sono in grado di agire da potenti antiossidanti e antinfiammatori. ^[4]Cutrim, Camila Sampaio, and Marco Antonio Sloboda Cortez. A review on polyphenols: Classification, beneficial effects and their application in dairy products. International Journal of Dairy … Continue reading

Vista l’abbondanza di fonti di terpeni e polifenoli, l’articolo si concentrerà solo sui fitocannabinoidi, che vengono prodotti anche da altre piante, ma in quantità e in numero molto inferiori rispetto alla cannabis. ^[5]Arif, Yamshi, et al.
Phytocannabinoids Biosynthesis in Angiosperms, Fungi, and Liverworts and Their Versatile Role.
Plants 10.7 (2021): 1307.

I fitocannabinoidi, tra i quali troviamo tetraidrocannabinolo (THC), cannabidiolo (CBD), cannabigerolo (CBG) e molti altri, sono molecole che vengono prodotte principalmente dalle piante di sesso femminile durante il periodo di fioritura: quando viene percepita una diminuzione delle ore di luce ricevute, la pianta inizia a sviluppare infiorescenze sulle quali si trovano in grande quantità strutture apposite, i tricomi ghiandolari, responsabili della loro produzione e del loro accumulo. ^[6]Small, Ernest, and Steve GU Naraine. Size matters: evolution of large drug-secreting resin glands in elite pharmaceutical strains of Cannabis sativa (marijuana). Genetic resources and crop evolution … Continue reading

Se la coltivazione di poche piante non presenta particolari difficoltà, la coltivazione della cannabis su scala industriale comporta una serie di problematiche da non sottovalutare:

• Il ciclo vitale della pianta è piuttosto lungo: partendo dal seme, si hanno in media dai 15 ai 30 giorni per la fase vegetativa, a cui si sommano 45-65 giorni per la fioritura, più il tempo necessario per l’eventuale essiccamento e i successivi trattamenti;
• La coltivazione indoor, indispensabile quando si parla di piante medicinali, richiede un grande consumo energetico, ^[7]Mills, Evan.
  The carbon footprint of indoor Cannabis production.
  Energy Policy 46 (2012): 58-67. inoltre lo stabilimento deve soddisfare le GACP e le GMP (rispettivamente, Good Agricultural and Collection Practices e Good Manufacturing Practices), la cui implementazione richiede tempo e denaro; ^[8]https://www.cannabissciencetech.com/view/gacp-and-gmp-in-the-medicinal-cannabis-industry-is-there-a-clear-difference
• Ottenere una coltivazione uniforme richiede personale qualificato e un costante monitoraggio di un gran numero di parametri (illuminazione, temperatura, umidità, ventilazione, fertilizzazione, quantità di anidride carbonica, illuminazione).

Per ovviare a questi problemi, i ricercatori di tutto il mondo lavorano da anni per trovare metodi più efficienti per ottenere cannabinoidi su larga scala.

Uno dei primi approcci utilizzati è stato quello della classica sintesi chimica; purtroppo, data la complessità molecolare dei cannabinoidi, sono necessarie molte reazioni per arrivare al prodotto finale, inoltre spesso le rese non sono alte e vengono prodotti diversi composti indesiderati. In poche parole, non è un approccio green. ^[9]Mechoulam, Raphael, Paul Braun, and Yehiel Gaoni.
Syntheses of. DELTA. 1-tetrahydrocannabinol and related cannabinoids.
Journal of the American Chemical Society 94.17 (1972): 6159-6165.

Con il passare degli anni e con il continuo miglioramento delle conoscenze in campo biotecnologico, gli addetti ai lavori hanno sviluppato processi di produzione che vengono applicati quotidianamente a moltissime piante medicinali, e che hanno rivoluzionato il modo in cui vengono ricavati i loro metaboliti bioattivi. ^[10]Chandra, Suman. 
Biotechnology for medicinal plants.
Heidelberg, New York: Springer, 2013.

2. Produzione di metaboliti secondari con metodi biotecnologici

Le tecniche biotecnologiche più utilizzate per produrre molecole di interesse farmaceutico e non, sono:

• Bioprocessing, termine con cui si intende la sintesi di metaboliti preziosi ottenuta facendo crescere, in vitro o in appositi reattori, cellule, tessuti oppure organi di una data pianta. ^[11]Moo-Young, Murray. 
  Comprehensive biotechnology.
  Elsevier, 2019. Per quanto riguarda la cannabis, non si tratta di un approccio molto produttivo: le singole cellule e i calli (ammassi di cellule indifferenziate) si sono dimostrati incapaci di sintetizzare i fitocannabinoidi, inoltre alcuni studi hanno evidenziato che questi sono tossici nei confronti delle cellule a concentrazioni maggiori di 50 µM. ^[12]Flores-Sanchez, Isvett Josefina, et al.
  Elicitation studies in cell suspension cultures of Cannabis sativa L.
  Journal of biotechnology 143.2 (2009): 157-168. ^[13]Pacifico, Daniela, et al.
  Time course of cannabinoid accumulation and chemotype development during the growth of Cannabis sativa L.
  Euphytica 160.2 (2008): 231-240. ^[14]Morimoto, Satoshi, et al. Identification and characterization of cannabinoids that induce cell death through mitochondrial permeability transition in Cannabis leaf cells. Journal of Biological … Continue reading Anche la coltivazione di hairy roots, particolari radici ottenute in seguito all’infezione con il batterio Rhizobium rhizogenes e che sono in grado di produrre metaboliti secondari, non ha dato gradi risultati. ^[15]Wahby, Imane, Juan Manuel Caba, and Francisco Ligero.
  Hairy root culture as a biotechnological tool in C. sativa.
  Cannabis sativa L.-Botany and Biotechnology. Springer, Cham, 2017. 299-317.
• La cultura di endofiti, i quali sono funghi o batteri che crescono all’interno dei tessuti di ogni pianta; essi sono noti per generare alcune molecole prodotte anche dalla pianta che li ospita, ma per quanto riguarda la cannabis, simili endofiti non sono conosciuti, inoltre la ricerca a riguardo è agli albori. ^[16]Wang, Jianfeng, et al.
  Taxol from Tubercularia sp. strain TF5, an endophytic fungus of Taxus mairei.
  FEMS Microbiology Letters 193.2 (2000): 249-253. ^[17]Taghinasab, Meysam, and Suha Jabaji.
  Cannabis microbiome and the role of endophytes in modulating the production of secondary metabolites: an overview.
  Microorganisms 8.3 (2020): 355.
• L’uso della biologia sintetica, definita come “la progettazione e la costruzione di nuove parti, dispositivi e sistemi biologici e la riprogettazione di sistemi biologici naturali esistenti per scopi utili”. ^[18]https://www.nature.com/subjects/synthetic-biology L’ingegneria metabolica rientra sotto questa categoria e consente di modificare l’espressione di determinati geni, permettendo ad esempio l’aumento dell’espressione degli enzimi chiave nella sintesi di una data molecola, oppure l’inibizione di pathway metabolici competitivi (come lo sono quelli del THC e del CBD), o non desiderati. ^[19]Gandhi, Sumit G., Vidushi Mahajan, and Yashbir S. Bedi.
  Changing trends in biotechnology of secondary metabolism in medicinal and aromatic plants.
  Planta 241.2 (2015): 303-317. Un altro approccio è quello di introdurre in organismi esterni, tipicamente lieviti, funghi, batteri o alghe, tutta la sequenza metabolica che porta alla produzione del metabolita desiderato; in questo caso si parla di produzione o espressione eterologa di un dato pathway (via metabolica) sintetico. ^[20]Vasilev, Nikolay.
  Medicinal Plants: Guests and Hosts in the Heterologous Expression of High-Value Products.
  Planta Medica (2021).

Per poter usare ciascuna di queste strategie, è di fondamentale importanza la conoscenza di tutti gli aspetti del pathway responsabile della sintesi del composto desiderato.

3. Produzione eterologa di cannabinoidi

La sintesi e lo stoccaggio in planta dei fitocannabinoidi avvengono principalmente in tre zone dei tricomi ghiandolari: nel citosol e nei plastidi delle cellule secretorie avviene la maggior parte della sintesi, mentre gli ultimi step metabolici e lo stoccaggio avvengono nella cavità extracellulare soprastante queste cellule. ^[21]Small, Ernest, and Steve GU Naraine. Size matters: evolution of large drug-secreting resin glands in elite pharmaceutical strains of Cannabis sativa (marijuana). Genetic resources and crop evolution … Continue reading Per semplicità verranno illustrati solo i passaggi più importanti.

Nel citosol delle cellule secretorie, l’acido esanoico viene prodotto probabilmente partendo dagli acidi grassi; grazie all’enzima acyl-activating enzyme 1 (AAE1), l’acido esanoico viene poi legato al coenzima A (CoA) formando esanoil-CoA.

Questa molecola viene allungata dalla Olivetolo sintasi (OLS), usando malonil-CoA come fonte di carbonio. Il tetrachetide risultante viene ciclizzato dalla acido olivetolico ciclasi (OAC), con conseguente produzione di acido olivetolico (OA), che viene trasportato nei plastidi. ^[22]Small, Ernest, and Steve GU Naraine. Size matters: evolution of large drug-secreting resin glands in elite pharmaceutical strains of Cannabis sativa (marijuana). Genetic resources and crop evolution … Continue reading

All’interno dei plastidi intanto, il geranil-pirofosfato (GPP) viene sintetizzato attraverso il pathway degli isoprenoidi indipendente dal mevalonato (MEP pathway). Sempre in questo compartimento, l’acido cannabigerolico sintasi (CBGAS), usa GPP e OA per formare l’acido cannabigerolico (CBGA), cioè il primo cannabinoide prodotto nel pathway.
Il CBGA infine viene secreto nella cavità extracellulare, dove viene utilizzato in larga parte per sintetizzare altri fitocannabinoidi, mediante l’azione di diversi enzimi. ^[23]Gülck, Thies, and Birger Lindberg Møller.
Phytocannabinoids: origins and biosynthesis.
Trends in Plant Science (2020). Modifiche nei prodotti di partenza, negli enzimi coinvolti, nelle condizioni di reazione o di stoccaggio di queste molecole, portano alla produzione di altri fitocannabinoidi.

Una volta noti tutti i substrati e i prodotti di queste reazioni, i relativi enzimi chiave e i geni che codificano tali proteine, non ci è voluto molto prima che gli scienziati riuscissero a introdurre all’interno di microorganismi più facili da coltivare, delle sequenze di DNA specifiche al fine di riprodurre il pathway sintetico dei fitocannabinoidi.

Ad oggi, i geni della cannabis sono stati introdotti con successo in lieviti, batteri, ma anche alghe che vengono fatte crescere in appositi reattori; ^[24]Luo, Xiaozhou, et al.
Complete biosynthesis of cannabinoids and their unnatural analogues in yeast.
Nature 567.7746 (2019): 123-126. ^[25]https://patents.google.com/patent/US20200291434A1/en ^[26]https://algae-c.com/our-technology/ i cannabinoidi prodotti vengono poi conservati nelle loro cellule in appositi organelli, nel caso di alghe e lieviti, oppure vengono secreti nell’ambiente circostante, nel caso dei batteri.

In ogni caso, la loro produzione avviene indipendentemente dalla stagione e il processo di purificazione è di gran lunga semplificato in confronto a quanto avviene usando la pianta come fonte di cannabinoidi.

In più, non sono necessari impianti costosissimi da costruire e mantenere, sicuramente un bel vantaggio.

4. Conclusioni e sguardo al futuro sulla produzione eterologa dei cannabinoidi

L’ingegneria metabolica e in particolare la produzione eterologa dei cannabinoidi rappresentano approcci efficienti, flessibili ed ecosostenibili per produrre cannabinoidi in grande quantità, perciò l’uso di queste tecnologie non potrà che aumentare nel tempo.

Una delle prospettive più interessanti per il futuro è data dalla possibilità di produrre cannabinoidi minoritari, come la tetraidrocannabivarina (THCV) o il cannabicromene (CBC), attraverso un’opportuna ingegnerizzazione microbica. Questi cannabinoidi hanno dimostrato attività farmacologica e la loro attività necessita di essere approfondita, ma purtroppo la loro bassa disponibilità è d’ostacolo alla ricerca. ^[27]Zagzoog, Ayat, et al.
In vitro and in vivo pharmacological activity of minor cannabinoids isolated from Cannabis sativa.
Scientific reports 10.1 (2020): 1-13.

Inoltre, nuovi cannabinoidi possono essere ottenuti mediante l’introduzione o l’ingegnerizzazione di appositi enzimi durante o dopo il pathway sintetico dei cannabinoidi, creando molecole più efficaci di quelle naturali; questo ad esempio è già una realtà in alcuni Paesi, come la Danimarca. ^[28]https://octarinebio.com/

È entusiasmante constatare che anche in Italia, la società biotecnologica Herbolea Biotech, con sede a Firenze, ha recentemente finalizzato un primo round di finanziamento lo scorso Ottobre 2021 per 5 milioni di euro. Herbolea utilizza biotecnologie che applicano processi enzimatici. ^[29]https://www.herbolea.com/news

Infine, i metodi di produzione andranno ottimizzati per ottenere processi sempre più proficui, magari usando altri microorganismi finora inutilizzati.

Per concludere, si può affermare che il campo della produzione eterologa dei cannabinoidi è ancora nella sua infanzia e ulteriori studi saranno necessari per affinare i protocolli di produzione degli organismi ingegnerizzati e i loro processi metabolici; tuttavia, questa tecnica rappresenta sicuramente una nuova frontiera nel campo della cannabis che permetterà a sempre più persone di beneficiare degli effetti terapeutici dei cannabinoidi.